ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN
Efecto de etilenglicol y leche en polvo en la criopreservación
de semen de bocachico Prochilodus magdalenae
Effect of ethylene glycol and milk powder in the cryopreservation
of bocachico semen Prochilodus magdalenae
Víctor Atencio-García*, Soad Samira Cabrales-Hessen**, José Alonso Espinosa-Araujo***
DOI: 10.15446/rev.colomb.biote.v23n2.91188
RESUMEN
Bocachico Prochilodus magdalenae es una especie endémica y la más importante de la pesquería continental colombiana. No obstante, sus capturas han disminuido aproximadamente el 67% en los últimos cuarenta años, por tanto ha sido categorizada como
vulnerable a la extinción. La criopreservación de semen, es una herramienta biotecnológica de conservación por tanto el objetivo
del presente estudio fue evaluar la criopreservación de semen de bocachico con etilenglicol (EG) y leche en polvo descremada
(LP). La solución crioprotectora estuvo compuesta por EG (6, 8 o 10%), LP (3, 5 o 7%) y glucosa 6%. La calidad del semen descongelado se evaluó con un software tipo CASA (computer assisted semen analysis). El porcentaje de inclusión de EG, no afectó significativamente ninguno de los parámetros de calidad seminal evaluados (p>0,05), a excepción de la tasa de eclosión (p<0,05); mientras que, la LP afectó significativamente el porcentaje de espermatozoides estáticos (p<0,05) y las tasas de fertilización y eclosión
(p<0,01). La mayor movilidad total se obtuvo cuando EG se incluyó a 10% y la LP a 7% (38,4±18,4%) (p<0,05); pero las mayores
tasas de fertilización (54,3-64,2%) y eclosión (47,7-57,5%) se obtuvieron cuando EG se incluyó a 6 u 8% y la LP se incluyó a la
menor concentración evaluada (3%), sin observarse diferencia significativa entre estos tratamientos (p>0,05). Los resultados permiten concluir que la combinación EG 6% con LP 3% permiten la criopreservación de semen de Prochilodus magdalenae de buena
calidad y capacidad fecundante.
Palabras clave: conservación, crioprotectores, espermatozoides, peces neotropicales, reproducción
ABSTRACT
Bocachico Prochilodus magdalenae is an endemic species and the most important of the Colombian continental fishery. Its catches
have decreased by approximately 67% in the last forty years and, it has been categorized as extinction vulnerable. Semen cryopreservation is a biotechnological conservation tool; therefore, the aim of this study was to evaluate bocachico semen's cryopreservation with ethylene glycol (EG) and skimmed milk powder (LP). The cryoprotective solution was composed of EG (6, 8 or 10%), LP
(3, 5 or 7%) and glucose at 6%. The quality of the thawed semen was evaluated with CASA software (computer assisted semen
analysis). The inclusion percentage of EG did not significantly affect any of the evaluated semen quality parameters (p>0,05), except
for the hatching rate (p <0.05). In contrast, LP presented significant effects on the percentage of static sperm (p <0,05) and on fertili-
*
**
***
Ing. Pesquero, Esp, MSc, Universidad de Córdoba/CINPIC, Montería, Col, email: vatencio@correo.unicordoba.edu.co,
https://orcid.org/0000-0002-2533-1995.
Profesional en Acuicultura, MSc (c), Universidad de Córdoba/CINPIC, Montería, Col, email: soadsamira@hotmail.com.
Profesional en Acuicultura, MSc, Universidad de Córdoba/CINPIC, Montería, Col, email: joseespinosa@hotmail.com,
https://orcid.org/0000-0001-9737-1163.
Criopreservación
de semen
de bocachico
Rev. Colomb. Biotecnol.
Vol. XXIII
No. 2 Julio - Diciembre 2021, 25 - 35
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zation and hatching rates (p<0,01). The highest total motility was achieved with EG included at 10% and the LP 7% (38,4±18,4%)
(p<0,05); but the highest fertility rates (54,3-64,2%) and hatching (47,7-57,5%) were registered when EG included at 6 or 8% and LP
included at the lowest rate evaluated (3%), no significant difference was observed between these treatments (p>0,05). The results
allow us to conclude that the combination EG 6% with LP 3% allows the cryopreservation of Prochilodus magdalenae semen of
good quality and fertilizing capacity.
Keywords: conservation, cryoprotectants, neotropical fishes, reproduction, spermatozoa.
Recibido: Diciembre 26 de 2020
Aprobado: Diciembre 17 de 2021
INTRODUCCIÓN
intracelular (Kumar & Betsy, 2015; Moskovtsev et al.,
2012).
Bocachico Prochilodus magdalenae, especie endémica y
el principal recurso de la pesquería continental colombiana, fue catalogada como vulnerable a la extinción
(Mojica et al., 2012). En los últimos cuarenta años, su
captura ha disminuido aproximadamente 67%, pasando
de 38000 ton en 1978 a 12728 ton en 2017 (De la Hoz
et al., 2017). Entre las principales causas de este declive
se señalan la degradación ambiental, la pérdida de conectividad de los ríos, pérdida de planos inundables así
como la fuerte presión pesquera. También se le considera una alternativa para la piscicultura de recursos económicos limitados y de seguridad alimentaria por las ventajas que representa su hábito detritívoro, ya que sus cultivos no son dependiente de las dietas comerciales.
La crioconservación de semen de peces es una importante herramienta biotecnológica que se destaca por su
contribución al establecimiento de bancos de recursos
genéticos, disminución de la presión pesquera sobre las
poblaciones silvestres y conservación de especies amenazadas o en peligro de extinción (Boskurt, 2018;
Kumar & Betsy, 2015; Atencio-García et al., 2015; Bobe
& Labbé, 2009; Medina-Robles et al., 2005). También la
criopreservación permite el aseguramiento de semen de
calidad, libre de enfermedades y por tanto se considera
un método seguro para el suministro de alevinos a la
industria piscícola (Cabrita et al., 2014). Además, ayuda
a la reducción de los costos en las granjas productoras
de alevinos, ya que permite el transporte de semen entre diferentes granjas evitando el traslado de reproductores (Cabrita et al., 2010; Martínez-Páramo et al., 2017;
Judycka et al., 2019) y permite reproducciones en cautiverio cuando se presenta asincronía en la maduración
gonadal entre machos y hembras (Boskurt, 2018).
Para criopreservar semen es necesario proteger a la célula con sustancias conocidas como crioproptectores
que de acuerdo a, su capacidad para penetrar la membrana plasmática pueden ser permeables o impermeables (Xin et al., 2017). Los crioprotectores permeables
deben ser hidrosolubles y de baja toxicidad para minimizar los daños criogénicos y evitar la formación de hielo
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El semen de bocachico se ha criopreservado utilizando
dimetilacetamida (DMA), (Atencio-García et al., 2013) y
dimetilsulfóxido (DMSO) (Atencio-García et al., 2015).
En ambos estudios el crioprotector permeable estuvo
acompañado de yema de huevo (YH) y glucosa como
diluyente. Sin embargo, los protocolos de crioconservación son específicos y deben ser optimizado para cada
especie (Atencio-García et al., 2014; Glogowsky et al.,
1999). Por esta razón hay un interés de buscar protocolos alternativos de criopreservación más eficientes. Un
crioprotector interno o permeable que ha sido evaluado
con éxito en semen de peces es el etilenglicol (EG) un
polialcohol, de bajo peso molecular (62,07 g/mol) y alta
permeabilidad celular (Choez, 2016). En el bagre Sorubim cuspicaudus, el semen criopreservado con EG mostró una tasa de eclosión similar a la obtenida con semen
fresco (Atencio-García et al., 2014).
Entre los crioprotectores no permeables más usados en
la criopreservación de semen de peces se destaca la
yema de huevo, en combinación con glucosa como
diluyente (Viveiros & Gondinho, 2009). Sin embargo, a
pesar de los beneficios de la yema de huevo, su uso
podría generar problemas de bioseguridad (riesgo sanitario) que incluyen la producción de metabolitos y toxinas perjudiciales y el riesgo de infección, resultando en
la reducción de la calidad del semen (Akhter et al.,
2012; Yildiz et al., 2013). Por otro lado, no siempre es
posible combinarla con algunos crioprotectores permeables (Maria et al., 2006).
Una alternativa de reemplazo de la yema de huevo es la
leche en polvo; cuyas micelas de caseína, interactúan
con las proteínas de la membrana plasmática del espermatozoide protegiendo y evitando la remoción de fosfolípidos y colesterol de la membrana (Bergeron & Manjunath, 2006). También se ha sugerido que la caseína tiene un efecto antioxidante y por lo tanto confiere protección a los espermatozoides durante la congelación
(Salomon & Maxwell, 2000).
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Tabla 1. Tratamientos para la crioconservación de semen de Prochilodus magdalenae con etilenglicol (EG) y leche en
polvo (LP).
Por tanto el objetivo de este estudio fue evaluar la inclusión de diferentes porcentajes de etilenglicol (6, 8, 10%)
y leche en polvo descremada (3, 5, 7%) en la criopreservación de semen de P. magdalenae mediante la determinación de su calidad seminal y capacidad fecundante.
MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención del semen
El semen fue obtenido de reproductores de P. magdalenae de dos años de edad (n=23, 0,21±0,02 kg) mantenidos en cautiverio, en estanques en tierra (0,5 kg/m2) en
el Instituto de Investigaciones Piscícolas de la Universidad de Córdoba, CINPIC (Montería, Colombia) mediante inducción con extracto pituitario de carpa (EPC, Argent, USA) en dosis única de 4,8 mg/kg de peso vivo
(Atencio-García et al., 2013). El semen fue colectado seis
horas post-inducción e inmediatamente evaluado con el
software SCA® (Microptic, Vet 01, España). Para las
pruebas de fertilidad, hembras maduras (n=8, 0,23±0,03
kg) fueron inducidas a razón de 6 mg EPC/kg de peso
vivo, en dos aplicaciones, la primera correspondiente al
10% de la dosis total y 12 horas después el 90% restante (Atencio-García et al., 2013).
Tratamientos y criopreservación de semen
El semen fue criopreservado con etilenglicol (EG) (Sigma
Chemical, USA) como crioprotector interno, a tres porcentajes de inclusión (6, 8 o 10%) y leche en polvo descremada liofilizada (LP) como crioprotector externo, a
tres inclusiones (3, 5 o 7%) para un total de nueve tratamientos, cada uno por triplicado (tabla 1). Como diluyente se utilizó glucosa 6% (0,33 M) previamente calentada a 60°C; luego se adicionó el EG y la LP a los diferentes porcentajes de inclusión. El semen fue diluido en
la solución crioprotectora a razón de 1:3 (semen: solución) y envasado en pajillas de 0,5 mL a temperatura de
28±1°C.
El semen envasado en las pajillas fue introducido en un
termo de vapores de nitrógeno de 4 L (MVE, SC 4/2v,
USA) durante 30 minutos para su congelación. Posteriormente, las pajillas fueron trasladadas a un termo de
almacenamiento de 34 L (MVE, XC 34/18, Alemania)
Criopreservación de semen de bocachico
hasta su evaluación. Las pajillas se descongelaron por
inmersión directa en baño de agua a 35ºC durante 60
segundos, con la ayuda de un baño María serológico
programable (Mermmert, WNB 7, Alemania).
Evaluación de la calidad seminal
Volumen seminal y color. El volumen seminal se expresó en ml, se midió en viales aforados y permitió calcular
la cantidad de diluyente a preparar. El color del semen
se evalúo con el circulo cromático de ROSE y sirvió para
evidenciar la posible presencia de sustancias contaminantes como heces, orina o sangre (Atencio-García et
al., 2014).
Movilidad total, tipos de movilidad, velocidad y progresividad espermática. Se estimaron con el software SCA®
(Microptic, Vet 01, España) y un microscopio óptico de
contraste de fase (Nikon, E50i, Japón) con objetivo 10x;
para lo cual 0.25 µl de semen se colocaron en una cámara Makler (Sefi Medical Instruments, Israel) y se activaron con 75 µl de agua destilada (dilución 1:300). Se
consideró como movilidad rápida (tipo a) al porcentaje
de espermatozoide (sptz) con velocidades mayores a
100 µm/s, media (tipo b) a los espermatozoides con
velocidades menores de 100 µm/seg pero mayor de 50
µm/s y lenta (tipo c) al porcentaje de espermatozoides
con velocidades menores de 50 µm/s (Atencio-García et
al., 2013; Atencio-García et al., 2014). El software SCA®
también estimó la velocidad curvilínea (VCL); la cual se
definió como la distancia recorrida en función del tiempo (µm/s) en la trayectoria real del espermatozoide entre dos puntos; mientras que, la velocidad lineal (VSL) se
consideró como una trayectoria lineal del espermatozoide entre el primer y el último punto (Atencio-García et
al., 2013).
Tiempo de activación (duración de la movilidad). En
una cámara Makler fueron colocados 0.25 µl de semen
y activados con 75 µl de agua bidestilada (dilución
1:300). El tiempo de activación se midió desde el instante en que se adicionó la solución activadora hasta que
alrededor de 90% de los espermatozoides dejó de moverse, observando en un microscopio óptico de contraste de fase a 10x (Nikon, E50i, Japón).
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Concentración espermática. En un Eppendorf de 2 ml
se diluyó 1 µl de semen en 699 µL de glucosa 6%
(dilución 1:700), la mezcla se homogenizó durante cinco segundos en un vortex a 1200 rpm (Velp Scientifica,
Zxclasic, China). Se tomaron 10 µl de la dilución y se
colocaron en la cámara Makler para la estimación de la
concentración mediante el SCA®. Este procedimiento se
realizó por triplicado para obtener un valor promedio de
la concentración espermática de la muestra de semen
analizado.
Fertilidad y eclosión
Para la evaluación de las tasas de fertilización y eclosión,
se tomaron entre 0,5 y 1 g de ovocitos (~ 1500 ovocitos/g) los cuales fueron inseminados con semen criopreservado a dosis de 320000 sptz/ovocito de acuerdo con
lo sugerido por Atencio-García et al. (2015). Los volúmenes seminales se adicionaron a los ovocitos con una
micropipeta (Transferpette®, CE704174, Alemania) y se
activaron con 10 ml de agua destilada a temperatura
ambiente (28°C); luego se aumentó el volumen del agua
a 50 ml para la hidratación de los ovocitos. Finalmente
se depositaron en incubadoras experimentales de flujo
ascendente de 2 l de capacidad conectadas a un sistema cerrado de recirculación de agua.
Los procedimientos empleados en la manipulación de
los animales, se realizaron utilizando como referencia
las normas y procedimientos para el uso de animales en
laboratorio, señaladas por el Committe on Care and Use
of Laboratory Animal Resources (Janet-Garber, National
Research Council, USA 2010).
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Se utilizó un diseño completamente aleatorizado con
arreglo factorial 3x3, es decir dos factores (nivel de inclusión de EG y nivel de inclusión de LP), cada uno con
tres niveles. Todos los datos, previamente transformados
(arcsen), fueron sometidos a pruebas de normalidad
(test de Shapiro Wilk) y de homogeneidad de varianza
(test de Bartlett), cumplidos estos supuestos se realizó
un análisis de varianza (ANAVA) y finalmente para identificar diferencias entre los tratamientos se realizó una
prueba de rango múltiple de Tukey (p<0,05). Mediante
el análisis factorial se determinó el efecto de cada uno
de los factores de manera independiente y su interacción sobre cada una de las parámetros evaluados. Los
resultados fueron expresados en media ± desviación
estándar (DS). Los análisis se realizaron con ayuda del
Software estadístico R, versión R Studio 3.0.1.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tasa de fertilización. Se evaluó a las seis horas postfertilización (HPF), cuando los huevos se encontraban al
final de la gastrulación (cierre del blastoporo); con la
ayuda de una pipeta de vidrio de 0,5 cm de diámetro se
tomó una muestra al azar de por lo menos 50 embriones. Los embriones viables se observaron traslúcidos y
de apariencia normal; mientras que, los inviables se observaron opacos y/o blanquecinos. Este conteo se realizó tres veces en cada unidad experimental y luego se
estimó un valor promedio para cada unidad. La tasa de
fertilidad se calculó utilizando la siguiente ecuación
(Espinosa, 2013):
Tasa de eclosión. Se evaluó a las 11 HPF, cuando los
embriones se encontraban en fase de faringulación, tomando una muestra al azar de mínimo 50 embriones
(por triplicado por incubadora), considerando como
viables los embriones traslucidos y con movimiento e
inviables aquellos opacos y/o blanquecinos. La tasa de
eclosión se estimó utilizando la siguiente ecuación
(Espinosa, 2013):
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Característica del semen de bocachico. Las características del semen de bocachico obtenido por inducción
hormonal con EPC se muestran en la tabla 2. El semen
de color blanco, con volumen seminal (mayor de 2 ml)
por encima de los reportes previos para la especie por
inducción hormonal (0,7-1,3 mL) (Montes, 2018; Atencio-García et al., 2013), con alta movilidad (> 90%), alta
progresividad (> 70%), bajo porcentaje de espermatozoides inmóviles, tiempo de activación y concentración
espermática dentro del rango reportado para la especie
(Montes, 2018; Atencio-García et al., 2013).
Efecto de factores e interacción. La tabla 3 registra el
efecto de cada factor y su interacción. El porcentaje de
inclusión de EG (factor A), en el rango evaluado (6-10%)
no afectó significativamente (p>0,05) ninguna de los
parámetros de calidad seminal analizadas excepto la
tasa de eclosión (p<0,05). Mientras que, la LP (factor B)
tuvo efectos significativos sobre el porcentaje de espermatozoides estáticos (p<0,05) y muy significativos sobre
las tasas de fertilización y eclosión (p<0,01). De igual
forma la interacción de los factores solo afectó significativamente el porcentaje de espermatozoides estático
(p<0,05). Los resultados sugieren que la LP es un factor
crítico en la capacidad fecundante del semen descongelado de bocachico.
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Tabla 2. Características del semen de bocachico Prochilodus magdalenae obtenido por inducción hormonal con extracto pituitario de carpa (n=23).
Tabla 3. Efecto de etilenglicol (EG) y la leche en polvo (LP) y su interacción sobre la calidad seminal de
espermatozoides de Prochilodus magdalenae.
Mt, movilidad total; VCL, velocidad curvilínea; VSL, velocidad lineal; Pt, progresividad total; *, significativo (p<0,05); **, muy significativo (p<0,01); ns, no significativo.
Calidad del semen descongelado. En la tabla 4 se presenta la calidad seminal del semen descongelado. Los
resultados del presente estudio, sugieren que el proceso
de criopreservación y descongelación ocasionó una
disminución de la movilidad total, progresividad, espermatozoides rápidos y medios y un incrementó de los
espermatozoides estáticos. Las menores movilidades
totales (22,0-24,6%) se obtuvieron cuando el EG se incluyó al mayor porcentaje de inclusión (10%) y la LP a
5% o menos (EG10+LP3 y EG10+LP5). Pero cuando EG
Criopreservación de semen de bocachico
se incluyó a 6 u 8% a cualquier inclusión de la LP (3-7%)
las movilidades totales (27,8-34,3%) fueron similares a
las reportadas (~31%) por Atencio-García et al. (2013)
cuando criopreservó semen de bocachico con DMA (8
o 10%) y yema de huevo 12%. En el presente estudio,
los menores valores de progresividad total (0,7±0,5%) y
velocidades espermáticas (VCL entre 21,7±2,8 y
23,0±2,2 µm/s; VSL entre 5,0±1,1 y 5,3±2,1 µm/s) se
obtuvieron cuando EG se incluyó a 10% y la LP a 5% o
menos.
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Tabla 4. Calidad del semen descongelado de bocachico Prochilodus magdalenae criopreservado con etilenglicol y leche
en polvo liofilizada.
Letras diferentes en una misma fila indican diferencia estadística significativa (p<0,05). EG, etilenglicol (los números indican el porcentaje de inclusión); LP, leche en polvo liofilizada (los números indican el porcentaje de inclusión); Mt, movilidad total; VCL, velocidad curvilínea; VSL, velocidad lineal; Pt, progresividad total.
El EG también ha sido utilizado en la criopreservación
de semen de bagres como Sorubim cuspicaudus a inclusiones entre 6 y 10% con registros de movilidades inferiores a 30% (Espinosa, 2013). Atencio-García et al.
(2014) reportaron que la mejor movilidad total del semen criopreservado de S. cuspicaudus se obtuvo con EG
5% (36,9±9,1%) y sugirieron una relación inversa entre la
movilidad total y los porcentajes de inclusión de EG. Herrera-Cruz et al. (2019) obtuvieron movilidades entre 22,2
y 10,3% cuando criopreservaron semen de Pseudoplatystoma magdaleniatum con EG incluido a 5 o 10%.
La movilidad han sido considerado el parámetros más
utilizado para evaluar la calidad del semen fresco como
criopreservado . La movilidad del espermatozoide generalmente presenta una correlación positiva con la capacidad de fertilización, porque afecta la capacidad del
espermatozoide para alcanzar el ovocito para una fertilización exitosa (Rurangwa et al., 2004). Está ampliamente demostrado que la criopreservación disminuye la actividad metabólica y calidad de espermatozoide criopreservado (Cabrita et al., 2014; Xin et al., 2020). Una de
las principales razones de la disminución de la actividad
metabólica y la baja calidad de los espermatozoides
descongelado es la alteración de las estructuras mitocondriales y la membrana en la parte media durante la
criopreservación (Figueroa et al., 2017). Estas alteraciones afectan la función mitocondrial, incluyendo los procesos bioquímicos involucrados en la producción de
ATP (Figueroa et al., 2015) y por tanto disminuyen la
energía disponible para la movilidad. Los espermatozoides requieren ATP para cumplir con múltiples funciones
celulares y eventos bioquímicos, tales como el mantenimiento de la motilidad y la activación de la fosforilación
para la fertilización exitosa (Miki, 2010).
30
Otras de las causas que afectan la movilidad espermática es el daño a la membrana espermática; lo cual ocasiona pérdida de algunos componentes internos de la
célula y reducen su actividad enzimática (Dietrich et al.,
2015). Martínez-Páramo et al. (2012) consideran que los
procesos de congelación y descongelación inducen alteraciones en la bicapa lipídica de la membrana del espermatozoide, ocasionando su desestabilización y la pérdida de componentes celulares. Estas alteraciones no sólo
afectan la movilidad y la viabilidad espermática sino también aumentan la peroxidación lipídica y el porcentaje
de espermatozoides estático.
Algunos estudios reportan que las proteínas, que generalmente se disminuyen en los espermatozoides durante
la criopreservación están asociadas a la disponibilidad
de energía para el movimiento como las de actividad
catalítica y al ATP (Dietrich et al. 2015; Nynca et al.
2015). Se ha reportado la disminución de la β-enolasa y
de la subunidad β de la ATP sintasa mitocondrial, miembros de una superfamilia de enzimas glucolíticas, que se
sugieren asociadas a la reducción de movilidad espermática y viabilidad en el proceso de congelación y descongelación, ya que estas enzimas desempeñan un papel principal en las vías metabólicas, como la gluconeogénesis y la glucólisis (Xin et al. 2018).
Otras causas que se reportan como causas de la disminución de la movilidad del semen descongelado, es el
criodaño sobre las proteínas citoesqueléticas, como la
dineína y la tubulina, que actúan en la movilidad celular
(Nynca et al. 2015). Se ha encontrado que las proteínas
del citoesqueleto son muy sensibles a los choques térmi-
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Figura 1. Porcentajes de fertilización (a) y de eclosión (b) con semen descongelado de Prochilodus magdalenae criopreservado con etilenglicol (EG) y leche en polvo (LP) a tres porcentajes
de inclusión. Letras diferentes en columnas indicas diferencia significativa (p<0,05). Valores
mostrados como media ± DS.
cos durante el proceso de congelación y descongelación (Xin et al., 2020).
Tasas de fertilidad y eclosión
En el presente estudio, a medida que aumentó la inclusión de la LP disminuyeron las tasas fertilidad y eclosión
(figura 1). Los resultados permiten inferir que el porcenCriopreservación de semen de bocachico
taje de inclusión de los crioprotectores (EG y LP) afectan
la capacidad fecundante del semen descongelado.
Cuando la LP se incluyó a 7% y se combinó con EG, a
cualquiera de los porcentajes evaluados (6, 8 o 10%), se
obtuvieron las menores tasas de fertilización (19,123,5%) y eclosión (13,2-17,7%); pero cuando EG se
incluyó a 6 u 8% y la LP a 3%, se obtuvieron los mejo-
31
res porcentajes de fertilización (54,3-64,2%) y eclosión
(47,7-57,5%). Estos resultados sugieren que el crioprotector EG debería incluirse a 6 u 8%; pero la LP no debería incluirse a más de 3%.
En otros estudios, el semen criopreservado de bocachico con DMSO 10% registró tasa de eclosión de
48,6±4,2% (Atencio-García et al., 2015) y con DMA 8%
de 50,1±9,8% (Atencio-García et al., 2013), en ambos
caso combinados con yema de huevo 12%. Tasas de
eclosión similares a las obtenidas en el presente estudio,
con semen criopreservado con EG 6 u 8% combinado
con LP 3%.
También, el semen descongelado de S. cuspicaudus
mostró adecuada tasa de eclosión (38,6±13,9%) cuando
se criopreservó con EG 5% y se observó que inclusiones
por encima del 5% disminuyen su capacidad fecundante
(Atencio-García et al., 2014); lo cual resalta la importancia de ajustar las inclusiones de los crioprotectores a la
particularidad de cada especie.
Por otra parte, a pesar de las bajas movilidades (<28%)
obtenidas con EG incluido a 6 u 8% combinado con LP
3%, en el presente estudio, se registraron adecuadas
tasas de fertilidad y eclosión. Se ha sugerido que, no
siempre altas movilidades, garantizan la viabilidad del
espermatozoide durante el proceso de reproducción
(Morris et al., 2012). Algunos estudios han reportado
bajas tasas de fertilizaciones (<20%) en Anguila anguila
(Asturiano et al. 2007) y Acipenser ruthenus
(Boryshpolets et al. 2011) con semen descongelado con
altas movilidades (~50%). Ramírez-Merlano et al. (2011)
con semen descongelado de Pseudoplatystoma metaense sin movilidad (0%) obtuvieron una fertilización del
10%. Algunos autores sugieren que parte de los espermatozoides inmóviles (estáticos) conservan intacta la
estructura cromosómica, la cual está contenida en el
núcleo de la cabeza, lo que permite la fecundación efectiva (Andrade et al., 2001; Grassiotto et al., 2001). Según
Rana et al. (1990) esto es posible porque algunos factores de los ovocitos pueden activar a los espermatozoides inmóviles. Además, Iwamatsu (2000) y Babin et al.
(2007) consideran que factores ambientales junto con
los factores liberados por los ovocitos, como pequeñas
moléculas de polipéptidos sintetizados en el folículo de
la célula y acumuladas en el corión, pueden producir
hiperactividad de la movilidad espermática en algunas
especies de peces.
Por tanto, la capacidad fecundante del espermatozoide
más que una buena movilidad o un parámetro en particular, requiere del bienestar integral del espermatozoide
32
o por lo menos en la mayor parte de sus parámetros
(Martínez & Pardo, 2010).
A pesar de que la combinación EG10%+LP3%, muestra
una tasa de fertilización que no difiere estadísticamente
(p<0,05) de las mejores combinaciones (EG6%+LP3% y
EG8%+LP3%) del semen descongelado; incluso no difiere de la combinación EG6%+LP5% (figura 1 a). Sin embargo, solo cuando se utilizó semen criopreservado con
EG 6 u 8% combinado con LP 3% se obtuvieron las
mejores tasas de eclosión. Es importante anotar que la
tasa de fertilización se midió a las 6 HPF y en este momento aún falta por expresarse daños a nivel de DNA
ocasionados en el proceso de criopreservación y descongelación, que son más visibles en la mayoría de los
casos, cuando se mide el porcentaje de eclosión a las
11 HPF. En otros estudios se ha reportado bajas tasas de
eclosión en huevos fertilizados de trucha arco iris Oncorhynchus mykiss (Cabrita et al., 2001) y carpa común
Cyprinus carpio (Zhou et al., 2006) que mostraron altos
niveles de fragmentación del DNA. Entonces, es importante resaltar que la capacidad fecundante del semen
criopreservado es más real cuando se evalúa más distante del momento de la fertilización.
CONCLUSIONES
Los resultados del presente estudio permiten sugerir que
la solución crioprotectora compuesta por EG 6%, glucosa al 6% y leche en polvo descremada al 3% es una
alternativa viable para la crioconservación de semen de
bocachico. Concentraciones de LP mayores a 3% pueden tener efecto negativo sobre el espermatozoide de
Prochilodus magdalenae, causándole disminución de su
capacidad fertilizante.
Agradecimientos
Al Instituto de Investigación Piscícola de la Universidad
de Córdoba CINPIC, por su contribución con la infraestructura, equipos y materiales necesarios para la realización de esta investigación.
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